[생화학] Salmonella gallinarum
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- 목차
-
1_ Bacterial Cell Culture
2_ Genomic DNA isolation from
Salmonella gallinarum and electrophoresis
3_ PCR (Polymerase Chain Reaction)
4_ SDS-PAGE
- 본문내용
-
2. Method
[실험재료]
premix, template & primer, D.W, mineral oil, thermocycler(PCR기계), Seakem LE agarose, gel caster, 1×TAE, EtBr, 마이크로피펫, 1.5㎖ tube
[실험방법]
① premix가 들어있는 20㎕ tube에 template DNA 1㎕, primer 2㎕를 D.W 17㎕를 넣고 잘 섞기 위해 vortexing 해준다.
② 적당하게 centrifuge 해준다.
- vortexing 시에 위로 쥔 용액들을 아래로 해서 넣어준다.
③ PCR tube에 용액을 옮겨준다.
- PCR tube 아래쪽은 온도가 잘 전달되도록 얇게 되어있으므로 꽉 쥐면, 깨진다. 따라서 깨지지 않도록 주의한다.
④ PCR시 물의 증발을 막기 위해 mineral oil을 20㎕넣어 coating한다.
⑤ tube 뚜껑에 annealing 적정온도를 찾기 위해서 setting할 온도를 적는다.(56, 58, 60, 62℃, 2℃씩 gradient를 주었다.)
⑥ 다시 vortexing 한 후, 이미 예열된 thermocycler(PCR 기계)에서 약 1시간 48동안 넣어 돌린다.
- PCR 기계의 상단부에는 ‘Top box’라는 부분이 있는데, 이 부분은 sample의 윗부분을 아랫부분보다 가열해주어 증발을 막는다. (105℃로 가열)
⑦ Thermocycler(PCR 기계)가 multi-chamber 형식으로 되어있기 때문에 자동으로 denaturation / annealing / renaturation 가 일어난다.
⑧ Denaturation at 95℃, 5min → 첫 denaturation
⑨ Denaturation at 95℃, 1min
⑩ Annealing at 56℃, 58℃, 60℃, 62℃[gradiently], 1min
⑪ Renaturation[polymerization] at 72℃, 1min
⑫ ⑨,⑩,⑪의 과정 × 30cycle
⑬ Renaturation at 72℃, 제일 마지막 cycle에서는 10min
- 반응이 안 된 것마저 반응시키기 위해서이다.
⑭ PCR이 완료되면, 증폭이 잘되었는지 확인하기 위해서 agarose gel electrophoresis를 실시한다.
✔ PCR시 고려해야 할 사항
(1) Pipetting & DNA template
여러 component를 혼합할 때에는 시료 간에 오염이 되지 않도록 주의하여야 하며 가능하면 공기를 통한 오염을 방지할 수 있는 tip을 사용하는 것이 좋다. 반응물 혼합 시에는 tube를 ice상에 두고서 혼합하여야 상온에서의 잘못 primer annealing에 의한 extension을 방지할 수 있다. 이론적으로 Taq DNA polymerase는 최적 온도 이하에서도 반응이 어느 정도 진행됨으로 상온 등에서 정확하게 annealing되지 않은 primer에 의한 임의의 반응이 진행됨으로써 원하는 size의 product 이외의 non-specific product가 만들어질 수 있다.
(2) Setting up the Laboratory
- 참고문헌
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- 개정 3판 단백질 실험노트 상 / 김승호, 장규태 역 / 월드사이언스
12~29p , 35~73p
- 필수세포생물학 308~312p / 대표역자 : 박상대 / 교보문고
- http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_20.php
(연세대 의대 생화학-분자생물학 교실)
- http://blog.naver.com/kidarime
- http://www.indstate.edu/thcme/micro/g-neg.html
- http://blog.naver.com/p820116
- http://blog.naver.com/killer3br
- http://blog.naver.com/lmsgood01
- http://blog.naver.com/estkim77
- http://blog.naver.com/tohmo
- http://kin.naver.com (네이버지식검색)
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