[생태학실험] Miniscale preparation of plasmid DNA 추출

Experimental Report on molecular biologyDNA sub-cloning& Polymerase Chain Reaction(PCR).Date2009. 11. 9 월요일Experiment – Digestion of DNA with Restriction EnzymeSubjects제한효소(restriction enzyme)로 원하는 유전자를 분리할 수 있다.Materials Plasmid, DDW, restriction enzymes (Nde I, BamH I), restriction enzyme reaction bufferEquipmentwater bath, brief centrifugePrinciple1. DNA를 자른다는 것은 nucleotide를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어여러 DNA 단편을 만들어 내는 것을 의미한다. 이 때, 이런 역할을 하는 효소

DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.TBE(Tris-borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.ProcedureMaterial & EquipmentRestriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x reaction buffer, 1 x TAE buffer, agarose, DNA ladder, DNA loading bufferPipette, binding column, spindown centrifuge, microwave, Electrophoresis tank, e-tubes, ice box, gel cast, vortexing machine, UV trans-illuminator, microcentrifuge tubeDigestion of DNA with Restriction Enzyme각각의 tube마다 Plasmid ony와 Inser

DNA분해 효소를 불활성화 시킨다. SDS(Sodium Dodecyl Sulphate)는 세포막의 지질 분자를 제거한다.c. 세포 추출물로부터 DNA의 정제Bacteria cell에는 DNA 이외에도 protein과 RNA를 가지고 있다. 따라서 DNA만을 추출하기 위한 방법이 필요하다. 1) protein 제거: Cell extract를 deproteinize하기 위해서는 phenol이나 1:1 mixture of phenol and chloroform을 첨가한다. 페놀은 유기용매로서 단백질을 변성시키거나 침전시킨다. 이 DNA와 RNA만 aqueous solution에 남기고 protein만 centrifugation으로 가라

preparation이라고 불리는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법이다. 특히 오늘 했던 방법은 알칼라인 라이시스 방법인데, 이는 쉽게 말하면, detergent로 세포막을 녹이고, 남은 크기 작은 supercolied plasmid DNA만 남게 만드는 것이다. 그 남은 supercolied plasmid이외의 것은 원심분리로 제거하고, 남은 것이 우리가 얻고자 하는 plasmid DNA인 것이다.이 실험을 하는 과정에서 어떤 것이 우리가 얻고자 하는 것인지를 헷갈리는 바람에 위에 것을 따야하는데, 실수로

DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 세포를 유지시키면서 세포벽만을 깨기 위해 solution Ⅰ을 넣는 것이다.Solution Ⅱ0.2M NaOH1% SDS(sodium dodecyl sulfate)Solution Ⅱ의 SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 역할을 한다. 또, NaOH는 DNA를 denaturate한다. 이는 Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 처리한다.Solution Ⅲ5M potassium acetate, glacial acetic acidSolution Ⅲ는 renature시키는 산성용액이다. 이 과정을 통해 Chromosomal DNA는 SDS와 potassium과 함