[공학] 단백질 분리 및 정제 실험
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- 목차
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(1) Sample Preparation
(2) Gel 만들기 – 이 과정부터 직접 실습한 내용임.
(3) Protein Quantification & Protein Determination
- 본문내용
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(2) Gel 만들기 – 이 과정부터 직접 실습한 내용임.
Purpose : Electrophoresis에 사용할 Acrylamide Gel을 만든다.
Principle:
• Acryamide-bisacrylamide 29:1 : solvent의 역할을 하며, 매우 강력한 신경독성(neurotoxic)을 나타내며 이 효과는 축척 되기 때문에 꼭 장갑을 착용하여야 한다. bisacrylamide를 가교제로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel 내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용되어 왔다.
• 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) : 단백질 내의 소수성 부분에 결합하여 단백질 분자들간의 소수성 부분의 결합 가능성을 억제시킨다. SDS는 또한 단백질의 많은 음전하를 제공하며, 단백질 내에서의 하전된 반응기들의 영향을 크게 감소시킨다. 이러한 상황에서는 단백질의 전기영동적 이동 또는 상대적 분자량의 대수(log)값에 반비례하는 특성이 생긴다.
• Separating buffer/ Stacking buffer : 두 buffer의 성분의 차이에 따라서 pH가 달라진다. stacking gel의 pH는 pH6.8이고 separating gel의 pH는 pH8.8이다. 일반적으로 amino acid 중 glycine의 pI(등전점)는 pH5.97이고 이때 zwitterion으로 분자 내에 양전하와 음전하 모두 가지게 된다. pI 보다 높은 pH에서는 음전하를 띄는데 stacking gel에서는 등전점에 가까운 pH이기 때문에 단백질들이 천천히 내려가고 이 원리로 tank buffer의 glycine이 polypeptide와 함께 starting point에 쌓이게 된다. 또한 separating gel에서는 높은 pH에 의해서 단백질이 음전하를 띠어 분리되기 시작한다.
• TEMED (N'-tetramethylethylenediamine) : ammonium persulfate로부터 생기는 free radical의 생성을 촉매 하여 acrylamide의 polymer 형성을 촉진시킨다. TEMED는 자유염일 때에만 작용하므로 낮은 pH에서는 polymer 형성이 방해를 받는다.
• APS(Ammonium Persulfate) : Acrylamide의 중합을 개시한다.
Material : Gel kit, 유리판 2개, Gel solution
Separating Gel Stacking Gel
DDW 3.2ml DDW 4ml
10%SDS 150.8㎕ 10%SDS 75.4㎕
Acrylamide 5ml Acrylamide 1.2ml
Separating buffer 3.8ml Staking buffer 0.8ml
TEMED 12.16㎕ TEMED3.68㎕
APS 3ml APS 1.4ml
Procedure:
1. Separating gel tube와 stacking gel tube에 각각에 해당하는 시약을 파이펫을 사용하여 담는다. (TEMED와 APS는 제외)
2. 두 개의 Gel casting frame을 조립한다. (gel이 새지 않도록)
3. Separating gel 에 APS와 TEMED를 넣고 파이펫을 사용하여 양쪽 frame에 각각 약 7ml의 gel을 초록색상단부의 1cm아래쪽까지 채운다.
4. Ethanol을 넣어서 표면이 기울어져서 굳지 않도록 한다. frame을 기울여보아 gel이 굳으면 ethanol을 따라낸다.
5. Stacking gel에 APS와 TEMED를 넣고 frame의 나머지를 채운 뒤, comb를 끼운다. (이때, 기포가 생기지 않도록 주의)
6. Gel이 굳으면 키트에서 유리판을 떼어내어 비닐에 싸서 4℃냉장고에 보관한다.
(3) Protein Quantification & Protein Determination
Purpose : Bradford method를 통해 단백질을 quantification하고 determination 해준다.
Principle:
• Bradfrod method:
M.bradford가 개발한 단백질 정량법. 단백질에 결합하는 색소인 쿠마시브릴리언트(Coomassie Brilliant)블루 G250이 단백질에 결합하면 그 극대흡수가 변화하는 것을 이용한 비색 정량 방법이다. 매우 간편하며 감도도 좋다. 이미 알고 있는 농도의 표준 단백질(소의 혈청알부민이 잘 사용)을 동시에 측정하여 농도를 산출한다. 완충액 등 여러 시약의 영향을 쉽게 받기 때문에 주의해야 한다.
Acidic environment reagent 조건 하에서 단백질은 coomassie dye에 안정적으로 결합하는데 이 결과로 reddish/brown form(465nm에서 최대 흡광)이 dyems blue form(610nm에서 최대 흡광)으로 스펙트럼 이동이 일어나게 된다. 두 가지 형태의 차이는 595nm에서 최대가 되는데, 따라서 이 파장이 coomassie dye-protein complex의 blue form을 측정하는데 최적의 파장이 된다
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