분자생물학실습

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목차: Ⅰ. DNA sub-cloning
1. 첫째 날
-Restriction enzyme 처리
-Gel electrophoresis(전기영동으로 FabG DNA와 pET-14b vector 확인)
-Gel purification으로 insert gene 분리
2. 둘째 날
-Ligation (pET-14b + FabG)
-Competent Cell 만들기
-Heat-Shock을 이용한 Transformation
-LB agar plate에 도말
3. 셋째 날
-Transformant 확인
-LB broth에서 증식시킴
4. 넷째 날
-Plasmid mini-prep -> kit를 이용하여 DNA를 얻고 plasmid를 분리
-분리된 plasmid를 다시 제한효소 처리하여 insert DNA가 삽입되었는지 확인
Ⅱ. Polymerase Chain Reaction

본문내용: 제한효소에 의해 잘린 DNA들을 분리한다.
2. Principle
1) agarose gel electrophoresis 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들
a. DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.
b. Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.
c. DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA > linear DNA > open circular DNA
d. 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.
e. 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.
f. Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15%정도 감소시킨다.
g. 전기영동 buffer의 성분과 이온강도도 electrophoresis speed에 영향을 미친다.
2) DNA loading buffer
Agarose gel의 well에 DNA를 넣어 줄 때, DNA 용액을 무겁게 하여 agarose의 홈으로 가라 앉히는 역할을 하며, 그 성분에는 전기 영동시 이동속도가 다른 두 개의 염색시약이 들어 있어, DNA와 같이 전기영동 될 때 DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
3) Electrophoresis buffer
TAE(Tris-acetate EDTA): DNA분자량이 큰 경우, agarose electrophoresis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA): DNA분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.
3. Reagents
Agarose, TAE buffer, etidium bromide, DNA ladder, DNA loading buffer
4. Apparatus
Microwave, gel cast, electrophoresis tank
5. Procedure
① 20ml의 1 X TAE 용액에 agarose 0.4g을 섞어서 2%로 만든다. 열을 가하여 완전 용해 시키고 Ethidium bromide를 1mg/ml 농도로 첨가한다.
② 충분히 섞어 젤을 굳히는 판에 붓고 식을 때까지 기다린다. (굳힐 때는 comb를 끼워서 well을 만든다.)
③ 전기 영동 tank에 1 X TAE를 넣은 후 gel을 넣는다. (이 때 TAE buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 붓는다.)
④ 2 µl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
⑤ 확인하고자 하는 plasmid DNA를 차례로 DNA loading buffer(1 µl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading한다.
⑥ 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가 충분히 분리되도록 한다. (Loading buffer의 이동위치 관찰)

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