Western Blotting protocol(웨스턴블랏팅 실험방법 프로토콜)

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하고 싶은 말: 대학원 석사과정 시 배웠던 웨스턴블랏 실험방법을 정리한 프로토콜입니다.
Protein Extraction, 단백질 정량(Bradford protein assay), SDS-Polyacrylamide gel 만들기, Electrophoresis(전기영동), Transfer, Immunoblot까지 모든 실험순서와 방법을 자세히 정리해두었습니다. 실험실에서 실제 사용하고있는 western blot 프로토콜입니다. 실제 실험을 하시는 분들에게 유용할 것이라고 생각되고, 리포트 쓰실때에도 실험 내용이 아주 자세히 적혀있어서 도움이 될꺼라 생각됩니다.

목차: I. Protein Extraction – Micro Smash MS-100 equipment 사용

II. 단백질 정량(Bradford protein assay)

III. SDS-Polyacrylamide gel 만들기

IV. Electrophoresis

VI. Transfer

VII. Immunoblot

VII. Expose

Ⅸ. Develope

Ⅹ. Total AB

본문내용: I. Protein Extraction – Micro Smash MS-100 equipment 사용

<실험 전 준비>
얼음(정사각형 스티로폼), E-tube 총 38개(8개×4세트->extract 옮길 것(sonication), centrifuge 상층액 뜰 것, 정량할 것, western 용/ 6개-> standard곡선 그릴 것), screw tube(cap-tube, 뚜껑 초록색) 8개

1. E-tube에 bead (큰 것 2개, 작은 것 10개) 넣어서 ice-rack에 꽂아 둔다.
2. 씻은 용액으로 고정해 둔 sample을 deep freezer에서 꺼내 ice-rack에 꽂아서
E-tube 뚜껑을 연다.(조직 안 쏟게 조심!) 30min동안 -20℃(밖의 냉동실)에 보관한다.
3. 그 동안 E-tube에 labelling 잘하기
4. Protein lysis buffer(=Honogenizing Buffer)→ deep freezer에서 분주해서 보관 녹여서 cap-tube에 일정량 분주한 후 조직을 넣어 얼음에 5분 정도 꽂아 둔다.
* Protein lysis buffer : Phosphosafe Extraction Reagent (Novagen, Cat#: 71296-3)
* 4mm 혈관 조직 한 개당 90ul 사용 (90ul × 8 = 720ul → 넉넉잡아 10개 조직으로 보고 900ul, volume 보정을 위해 2.1ml 분주)
* CPI-17 : 90ul/조직 1개 (Phosphosafe Extraction Reagent)
MYPT-1: 90ul/조직 1개 (manual lysis buffer)
* Phosphosafe Extraction Reagent : manual lysis buffer = 2:1
phosphosafe : 1.4ml(700ul×2넣음)/ manual : 0.7ml(700ul)

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