분자생물학-GFP발현
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- 하고 싶은 말
- 분자생물학 실험 중, GFP발현을 위한 실험방법에 관련된 자료입니다.
- 목차
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1. 제목
2. 목적
3. 배경지식
4, 실험방법
- 본문내용
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◎ Reporter Gene
형질전환을 한 후 실험자가 쉽게 자신의 형질전환체를 확인할 수 있게끔 만들어 주는 유전자를 말한다. Reporter Gene 사용하는 목적은 우선 형질전환된 유전자가 발현되었는지의 유무와 두 번째로 어느 정도의 양으로 발현되었는가 알아보기 위한 것이다. Reporter Gene으로 사용되는 것들은 GFP, Luciferase 등이 있다.
◎ Plasmid
Plasmid는 박테리아의 세포안에 존재하는 박테리아 크로모좀 이외의 작은 원형의 DNA분자 이다. 형태는 원형이고, 이중 나선으로 되어 있으며, 박테리아의 유전자와는 독립적으로 분열할 수 있는 능력을 가지고 있다. 그러한 이유로 유전자 클로닝을 위한 벡터로 많이 사용된다. 벡터란 유전자 클로닝시에 우리가 원하는 유전자를 숙주 세포안으로 이동시켜 그 안에서 다량으로 복제 가능하도록 하는 일종의 운반체를 말하며, 플라스미드는 그를 위한 조건을 가지고 있다. 우선 자가 복제를 위한 복제 기점 (origin of replication)을 가지고 있으며, 유전자의 발현, 즉, 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 promoter, 나중에 세포 배양에 의한 대량 생산 후에 플라스미드가 들어간 세포와 그렇지 않은 세포를 구별해 내기위한 selective marker, 그리고 숙주 안에서의 copy number를 조절하는 replicon, 그리고 원하는 유전자를 끼워 넣을 수 있는 insertion site 등을 가지고 있다. insertion site는 제한 효소에 의해 잘려질 수 있는 부위로 insertion site에 우리가 복제를 원하는 유전자를 삽입할 수 있다.
◎ T-vector
T-vector는 PCR을 마친 후 증폭된 DNA의 절편을 보관이나 다른 용도에 편하게 쓸 수 있도록 만든 것이다. PCR 결과물을 T-vector와 연결하여 circular form으로 만들어 준 후에 E.coli에 transformation한다. T-vector는 이름에서 볼 수 있듯이 직선형 DNA의 양끝에 overhang으로 T 서열을 가지고 있다. 이렇게 양끝에 T를 넣어준 이유는 Taq polymerase를 이용해서 PCR을 한 경우 원하는 서열 양끝쪽에 overhang으로 추가로 A 서열이 만들어진다. A와 T는 서로 상보적인 결합을 하므로 PCR 결과물의 A서열과 T-vector의 T서열은 서로 상보적인 결합을 하게 된다.
1. plasmid DNA isolation
- plasmid를 GFP를 운반하기 위한 Vector로 사용하기 위해 plasmid DNA를 isolation하여 한다. plasmid DNA를 isolation하는 방법 중 alkaline method를 사용하였다.
세균에서 plasmid DNA를 추출하기 위한 방법은 배양된 세균을 centrifuge 한 후, Solution I, II, III를 넣어서 DNA를 분리 한다.
●Solution I
50mM Glucos ,25mM Tris-Cl, 10mM EDTA로 구성되어 있고, 세균을 resuspension 시키기 위해 사용하며 세포 표면을 약화 시킨다. Glucos는 cell의 삼투압 유지하는 역할을 한
- 참고문헌
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Prescott, 2006, 미생물학, Mc Grow Hill, fifth edition, pp 297-303
오계현외, 2003, 미생물학실험, 신광출판사, 초판, pp 120-124
Taketoshi Taniguchi, 2002, PCR 실험 노트, 월드사이언스, 초판, pp12-14
김형원 외, 1998, 미생물학 실험서, 대학출판사, 초판 pp 192-194
이상섭 외, 2003, 미생물 분리와 동정, 신흥출판사, 3판, pp 93-95
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