[분자생물학 실습] DNA sub-cloning

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목차: ◇ Date: 20000. 00. 00 월요일
◇ Subject : DNA sub-cloning 1단계
◇ Principles
◇ Procedure
Experiment 1 – Digestion of DNA with Restriction Enzyme
Experiment 2 – Agarose Gel Electrophoresis
Experiment3- Gel Purification

◇ Date: 2000. 00. 00 화요일
◇ Subject: DNA sub-cloning 2단계, 3단계
◇ Principles
<ligation reaction의 그림.>
◇ Procedure
Experiment 1 – Ligation Reaction,
Experiment 2- Preparing Competent Bacteria
Experiment 3 – Heat Shock Transformation

◇ Date – 20000. 00. 00 수요일
◇ Subject: DNA sub-cloning 3단계
◇ Principles
◇ Procedure

Experiment 1- Selection of transformation

◇ Date: 20000. 00. 00 목요일
◇ Subject: DNA sub-cloning 4단계 clone 증폭
◇ Principles
◇ Procedure
Experiment 1 plasmid prep.
◇ Result and discussion

◇ Date: 20000. 00. 00 금요일
◇ Subject: Polymerase Chain Reaction
◇ Principles
①Ds DNA의 분리(denaturation)
② Primer의 결합(annealing)
③ DNA의 합성(polymerization)
◇ Procedure
◇ Discussion(총괄)
◇느낀 점

본문내용: HGU

◇ Date: 20000. 00. 00 월요일

◇ Subject : DNA sub-cloning 1단계

◇ Principles
Plasmid: Bacterial cell 내에 염색체와는 독립적으로 존재하며 독자적으로 증식할 수 있는 Circular DNA로 세균의 생존에 필수적인 것은 아니다. Plasmid는 대부분 하나 이상의 유전자를 가지고, 이들 유전자는 종종 Host bacteria에 의해 나타나는 유용한 특징을 담당하고 있다. 예를 들어, 항생제의 정상적인 독성 농도에서 생존하는 능력은 항생제 저항성 유전자를 가진 Plasmid가 Bacteria 안에 존재 하기 때문이다. 이러한 항생제 저항성은 실험실에서 종종 Selectable marker로서 이용된다. 이 같이 Plasmid에는 약제에 대한 저항성을 가진 내성인자, 세균의 자웅을 결정하는 성 결정인자 등이 발견되고 있다. 또한 Plasmid는 다른 종의 세포 내에도 전달된다.

제한효소: DNA의 특정부위를 자르거나 붙일 수 있다. DNA를 자른다는 것은 DNA의 Nucleotide들이 연결되어 있는 Phosphodiester 결합을 끊어내는 것을 의미한다. 이런 역할을 하는 효소를 Nuclease라고 하며 바깥쪽을 자르느냐 안쪽을 자르느냐에 따라 Exonulcease와 Endonuclease의 두 종류로 나뉜다. 이 중 Endonuclease의 대표적인 것이 바로 제한효소이다. DNA에 존재하는 특정한 염기서열은 인식하고 그 주변의 특정 부위를 절단한다. 본디 제한효소는 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오는 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전으로 가지고 있다. 특정한 염기서열을 인식하는 특징 때문에 외부 DNA만 식별해서 잘라낼 수 있다.

Restriction enzyme 처리: Plasmid를 Restriction enzyme 처리하는데 있어서 한가지 Enzyme만 사용하면 자른 후 다시 그 잘라진 부위끼리 붙을 가능성이 크다. 따라서 두 가지 종류의Enzyme을 사용하여 두 부분으로 각각 잘라서 잘라진 Plasmid의 면들이 서로 다시 붙는 현상을 방지한다. 두 가지 Enzyme에 의해 잘라진 Plasmid의 면들은 서로 그 면의 모양이 달라서 잘 붙지 않는다. 두 가지의 제한효소를 사용하기 위해선 두 제한효소로 잘리는 부위가 너무 가깝지는 않은지 검토해보아야 하고, 두 제한효소의 반응 조건도 검토해보아야 한다. 고유조건이 같으면 고유 Buffer를 쓰고 다르면 One-phor-all buffer의 조건을 맞추고, 두 사항에 모두 맞지 않으면 어쩔 수 없이 하나씩 처리해야 한다.

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인식할 수 있는 염기서열이 정해져 있다참고문헌1. Molecular Cloning, 2nd edi., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory press, 19892. Basic Methods in Molecular Biology, 2nd edi., Davis et al., 3. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd edi., Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992 4. 기타 여러 시약회사에서 제공하는 자료들5. 인터넷 홈페이지 wwwyumc.yonsei.ac.kr/medicine/bioche/kor2.htm에서 실습지침서를 누르면 한글로 된 실험 protocol을 보실 수 있습니다.6. 분자생물학 노트, KAIST 유전공학 연구소

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