분자생물학실습보고서

  • 등록일 / 수정일
  • 페이지 / 형식
  • 자료평가
  • 구매가격
  • 2010.01.29 / 2019.12.24
  • 19페이지 / fileicon docx (MS워드 2007이상)
  • 평가한 분이 없습니다. (구매금액의 3%지급)
  • 1,400원
다운로드장바구니
Naver Naver로그인 Kakao Kakao로그인
최대 20페이지까지 미리보기 서비스를 제공합니다.
자료평가하면 구매금액의 3%지급!
이전큰이미지 다음큰이미지
목차
Experiment 1 : DNA sub-cloning
Ι. DNA sub-cloning 의 1단계(원하는 유전자를 분리)
Purpose
Principle
1. Genomic DNA의 분리
2. 제한효소(restriction enzyme)에 의한 유전자의 분리
3. 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의한 유전자의 분리
Procedure
Digestion of DNA with Restriction Enzyme
Agarose Gel Electrophoresis
Gel Purification
Ⅱ. DNA sub-cloning 의 2단계 : 얻은 유전자를 cloning vector에 삽입한다.
Purpose:
1. Cloning vector (pET-14b)
2. Ligation (pET-14b + FabG)
Material & Equipment
Procedure :
Ligation Reaction
Ⅲ. DNA sub-cloning 3단계 : 유전자가 삽입된 DNA를 세포 안으로 주입한다.
Competent cell 의 제작

Transformation (electroporation)
Genetic marker (X-gal & ampicilin)을 이용한 trasnformant 선발
Clone의 증폭
Experiment 2 Polymerase Chain Reaction
principle
I. RNA extraction
1. RNA 분리의 원칙
2. RNA의 분리
3. Quantification of DNA and RNA
II. Polymerase Chain Reaction (PCR)
1. PCR

1) dsDNA의 분리(denaturation)
2) Primer의 결합(annealing)
3) DNA의 합성(polymerization)
2. PCR 반응에 사용되는 각 성분에 대해 고려할 점.
1) Template DNA
2) Primer
3) dNTP (deoxynucleotide triphosphate)
4) 10 PCR 완충용액
5) Taq DNA polymerase
(Protocol for PCR reaction)
결과
Experiment 1
Experiment 2
토의
본문내용
2. 제한효소(restriction enzyme)에 의한 유전자의 분리
유전자 클로닝은 DNA분자를 아주 정확하고 반복적으로 절단할 것을 요구한다. 각 Vector 분자의 circle을 열어서 새로운 DNA가 삽입될 수 있도록 각 분자마다 하나의 같은 위치가 절단되어야 한다. DNA를 자른다는 것은 nucleotides를 연결하고 있는 phosphodiester bond를 끊어내는 것을 의미한다. 이러한 역할을 하는 여러 효소 중에 대표적인 것이 바로 제한효소이며, DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다. 제한효소의 발견이 된 최초 관찰은 host controlled restriction이라고 부른 현상이다. Phage DNA가 복제되어 새로운 phage particle을 합성하기 전에 bacteria가 phage의 DNA를 절단하는 효소를 생성하기 때문에 제한이 일어난다. 제한효소는 외부의 DNA가 침입해 들어오면 방어기전으로도 작용하는 효소이다. 자신의 DNA는 절단부위를 methylation 시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA를 자를 수 없게 보호하고 침입한 DNA를 잘라 자신을 보호한다.
제한효소에는 3가지 종류가 있는데 Type 1과 Type 3는 특정부위를 인식하지만 인식한 부위 주변을 절단하기 때문에 실험 목적으로는 잘 사용되지 않는다. Type 2는 인식부위와 절단 부위 모두에 특이성이 있는 제한효소이므로 실험에서 유용하게 사용되고 있다. 제한효소는 4,5,6개의 염기서열을 인식하는데 이에 따라 DNA상의 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다. 길이가 알려진 DNA분자에서 특별한 제한효소의 인식 염기배열의 수는 수학적으로 계산될 수 있다. 4개의 다른 nucleotide가 존재하는 확률로 계산할 수 있다. 하지만 모든 nucleotide가 같은 비율로 존재한다는 가정은 타당하지 않다. 많은 제한효소는 인식 염기배열의 가운데서 간단한 이중가닥 절단을 하며 그결과 blunt말단이 된다.(PvuⅡ AluΙ) 다른 다수의 제한효소는 정확하게 같은 지점이 아닌 둘 혹은 네개의 nucleotide를 엇물리게 절단하며 그결과 단가닥으로 구성된 sticky말단을 가진다.
예를들어 EcoRI이라는 제한효소가 인식하는 부위는
5'--GAATTC--3' 5'--G AATTC--3'
3'--CTTAAG--5' 를 인식해서 3'--CTTAA G--5' 와 같은 형태로 절단 한다. 한쪽 부분이 돌출되게 절단됬다고 해서 cohesive end (sticky end) 형태라고 한다.
Sma I 이라는 제한효소가 인식하는 부위는
5'--CCCGGG--3' 5'--CCC GGG--3'
3'--GGGCCC--5' 를 인식해서 3'--GGG CCC--5' 와 같이 수직으로 자르며 이를 blunt end 형태라고 부른다

3. 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 의한 유전자의 분리
a. Agarose gel 전기영동 시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들로는 DNA의 분자의 크기, Agarose의 농도, DNA 형태에 따라 이동속도가 다르다. 또 전압이 높을수록 전기장의 방향, Ethidium bromide, 전기영동 buffer의 성분과 이온의 강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.
b. DNA loading buffer
Agatose gel의 well에 DNA를 넣어 줄 때, DNA 용액을 넣어 줄 때, DNA 용액을 무겁게 하여 agarose의 홈으로 가라 앉히는 역할을 하며, 그 성분에는 전기영동 시 이동속도가 다른 두 개의 염색시약이 들어 있어, DNA와 같이 전기영동 될 때, DNA가 움직인 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.
c. 전기영동 buffer
TAE(Tris-acetate EDTA) : DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.
TBE(Tris-borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.

Procedure
Material & Equipment
Restriction enzymes(BamHI, NdeI), pET-14b, FabG gene이 inserted pET-14b plasmid, DDW , 10 x reaction buffer, 1 x TAE buffer, agarose, DNA ladder, DNA loading buffer
Pipette, binding column, spindown centrifuge, microwave, Electrophoresis tank, e-tubes, ice box, gel cast, vortexing machine, UV trans-illuminator, microcentrifuge tube

Digestion of DNA with Restriction Enzyme
1. 각각의 tube마다 Plasmid ony와 Inserted plasmid로 naming 한다.
2. Plasmid only와 inserted plasmid의 sample에서 각각 5μl 씩 채취하여 tube에 담는다.
3. DDW(증류수)를 2 μl씩 각각의 tube에 담는다.
4. 10x reaction buffer를 1 μl씩 넣는다.
5. 제한효소 (Nde Ι)를 1 μl씩 넣는다
6. 제한효소 (BamH Ι)를 1 μl씩 넣는다
->효소는 -20 ℃에서 50% glycerol이 들어있는 완충액 내에서 안정하게 존재하므로 실온에 노출되는 시간을 가능한 줄여야 한다.
7. Pipetting을 한다. 가능한 기포가 생기지 않도록 주의 하면서 섞는다.
8. 약 3-5초 동안 짧게 centrifuge 하여 반응할 재료들이 바닥에 모이도록 한다.
9. 37℃(효소가 반응하기 가장 좋은 온도)에서 1시간(제한 효소에 의해 잘리기에 충분한 시간:1~2시간) 동안 반응시켜 DNA가 충분히 절단되도록 한다.

Agarose Gel Electrophoresis
1. 20ml의 1 x Tris Acetate EDTA 용액에 agarose 0.4g을 섞어서 2%로 만들고, 열을 가해 완전히 녹인 다음 Ethidium bromide를 1mg/ml 농도로 첨가한다(10μl).
-> Ethidium bromide은 얇은 판 모양으로 생겼는데 이 판 모양이 DNA의 nucleotide사이사이에 끼어든다. 즉 DNA의 당과 염기 그 사이에 끼어드는 것이다. 이 Ethidium bromide은 자외선(UV)를 받으면 오렌지색으로 형광을 내며 이것으로 DNA의 양과 존재 유무를 알 수 있다. 젤에 넣고 전기 영동을 하는 경우에는 전개속도에 영향을 줄 수 있기 때문에 (전개 속도를 15%감소시킴) 나중에 염색하는 방법을 많이 쓰고 있다. 또한 매우 위험한 발암물질이므로 반드시 polyglove를 착용하여야 한다.
2. 충분히 섞어 젤을 굳히는 판에 붓고 식을 때까지 기다린다. (굳힐 때는 comb를 끼워 well을 만든다.)
3. 전기영동 tank에 1 x TAE를 넣은 후 gel을 넣는다. TAE buffer는 gel이 살짝 잠길 정도로 넣는다.
4. 2 μl의 100bp DNA ladder를 loading하여 DNA size marker로 사용한다.
5. 각각의 tube에 DNA loading buffer(1 μl)와 섞은 후, 각각의 well에 loading 한다. (DNA loading buffer는 agar에 가라앉히는 역할과 파란색 dye로 어디까지 내려왔는지를 알게 해주는 역할을 한다)
6. 75V 전압에서 전기영동을 하여, DNA가 충분히 분리되도록 한다(DNA의 경우는 인산기에 있는 negative charge가 gel의 positive charge쪽으로 움직이게 한다. 이동속도는 DNA크기 모양에 따라 다르기 때문에 종류에 따라 분리된다).
7. 전기영동이 끝난 후 UV trans-illuminator에서 DNA band를 확인한다.

Gel Purification
1. UV로 확인한 Agarose gel의 DNA band를 잘라서 각각 1.5ml microcentrifuge tube에 넣어 무게를 잰다(pET-14b, FabG).
2. 빈 tube의 무게와 1.에서 잰 무게의 차를 이용하여 gel의 무게를 정한다.
3. Gel의 3배 만큼의 Gel binding Buffer를 첨가한다.(gel을 녹인다)
4. 60℃에서 10분간 incubation하고 2~3분마다 vortex
자료평가
    아직 평가한 내용이 없습니다.
회원 추천자료
오늘 본 자료 더보기
  • 오늘 본 자료가 없습니다.
  • 저작권 관련 사항 정보 및 게시물 내용의 진실성에 대하여 레포트샵은 보증하지 아니하며, 해당 정보 및 게시물의 저작권과 기타 법적 책임은 자료 등록자에게 있습니다. 위 정보 및 게시물 내용의 불법적 이용, 무단 전재·배포는 금지됩니다. 저작권침해, 명예훼손 등 분쟁요소 발견시 고객센터에 신고해 주시기 바랍니다.
    사업자등록번호 220-06-55095 대표.신현웅 주소.서울시 서초구 방배로10길 18, 402호 대표전화.02-539-9392
    개인정보책임자.박정아 통신판매업신고번호 제2017-서울서초-1806호 이메일 help@reportshop.co.kr
    copyright (c) 2003 reoprtshop. steel All reserved.