[Transformation, DNA, E. coli, 플라스미드, Competent] Transformation of competent E. coli(예비 및 결과)

결과, FabG의 size는 1kb보다 약간 작음) 1. Date Day 2 – 2008년 10월 28일 화요일2. Subject & PurposeLigation Reaction & Preparing Competent Bacteria & Heat Shock Transformation실험 첫째 날에 제한효소로 Digestion하여 얻은 FabG gene을 cloning vector, pET-14b에 ligation시키고 E.coliJM109에 화학적 처리를 가하여 외부의 DNA를 잘 받아들일 수 있는 Competent Bacteria로 만든 다음 Heat shock을 가해서 bacteria가 재조합 plasmid를 받아들이게 한다. (Transformation) 3. Principle 1) Cloning vector(plasmid & pET-14b)- Plasmi

DNA의 절편을 보관이나 다른 용도에 편하게 쓸 수 있도록 만든 것이다. PCR 결과물을 T-vector와 연결하여 circular form으로 만들어 준 후에 E.coli에 transformation한다. T-vector는 이름에서 볼 수 있듯이 직선형 DNA의 양끝에 overhang으로 T 서열을 가지고 있다. 이렇게 양끝에 T를 넣어준 이유는 Taq polymerase를 이용해서 PCR을 한 경우 원하는 서열 양끝쪽에 overhang으로 추가로 A 서열이 만들어진다. A와 T는 서로 상보적인 결합을 하므로 PCR 결과물의 A서열과 T-vector의 T서열

DNA sub-cloning Sub cloning단계 1. 원하는 유전자 분리 (2010. 11. 15)- Restriction enzyme 처리- Gel electrophoresis - Gel purification2. Cloning할 유전자를 cloning vector(plasmid)에 삽입(2010. 11. 16)- Ligation- Competent cell 만들기- Heat-shock을 이용한 transformation- LB agar plate에 spreading3. 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입(2010. 11. 17)- Transformation 확인- LB broth에 transformant를 multiplication 4. 올바른 clone의 증폭(2010. 11. 18)- Plasmid mini-prep실험1 Digestion of DNA with Restriction Enzyme◈ Purpose Re

DNA15.5μl, 10x T4 ligation buffer 2μl, plasmid 1.5μl, T4 ligase 1μl를 넣어, 총 20μl의 sample을 만든다.※ insert(ng)=vector(ng) x insert(bp) x 10 / vector(bp)② 4도에서 over-night반응을 시킨 후 전기영동으로 결과를 관찰한다.DNA sub-cloning의 3단계: 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입한다.▣ 실험2. Preparation of Component Bacteria실험목적- 정상적인 E. coli에 물리적, 화학적 처리를 하여 cell wall을 약하게 만들어 외부의 DNA를 받아들일 수 있는 상태인 competent cell을 만드는 실험이다

결과로 단백질의 띠 들이 분리되며, 각 단백질은 그 알짜전하, 크기 및 모양 등에 의해 이동속도가 달라지게 됨으로써 고분해능을 지니게 된다.다. SDS-Gel ElectrophoresisSDS-PAGE는 단백질의 Molecular Weight를 추정하는데 쓰이는 간편한 방법이다. SDS-PAGE에서도 다른 Electrophoresis 방법에 쓰이는 Polyacrylamide Gel 이 사용된다. SDS-PAGE과정에서 중요한 것은 Sodium dodecyl sulfate와 mercaptoetanol을 첨가하는 것이다.Sodium dodecyl sulfate는 surfacant, 즉 long-nonpolar hydrocarbon tail과 polar